De Arsenal-middenvelder, die nog geen zes minuten op het veld stond, profiteerde van een slimme pass van Ferran Torres en rondde klinisch af voorbij Diogo Costa om een fel bevochten achtste finale in Dallas Stadium te beslissen.
Spanje blijft de enige ploeg die nog geen doelpunt heeft geïncasseerd in het toernooi en zal het in de laatste acht opnemen tegen de winnaar van de VS en België op vrijdag in Los Angeles.
De ploeg van Luis de la Fuente begon fel, met Diogo Costa die slimme reddingen verrichtte om Lamine Yamal en Alex Baena in snel tempo te ontzeggen.
Portugal kwam beter in de wedstrijd en had voor de pauze op voorsprong kunnen komen, Nuno Mendes zag een lage schot via een deflectie van Pedro Porro terugkaatsen op de lat. Mendes moest net na het uur geblesseerd het veld verlaten, een tegenslag voor de ploeg van Roberto Martinez.
Ronaldo, die zijn afscheidswedstrijd op het WK speelde, testte Unai Simon vanuit een scherpe hoek in de tweede helft, terwijl Bernardo Silva ook dichtbij kwam met een kopbal die net overging.
Met de wedstrijd die schijnbaar op verlenging afstevende, combineerden de invallers om de harten van de Portugezen te breken. Torres, die laat in de wedstrijd werd ingebracht, speelde Merino vrij en de Arsenal-man maakte geen fout, hij vond de nabijgelegen hoek voorbij Costa.
"De beslissende spelers waren degenen die van de bank kwamen. Ik zei tegen Merino dat hij moest spelen zoals hij altijd doet. Zijn rol is om de middenvelders en de aanvallers te ondersteunen. Met hem dachten we eraan het team de ritme en energie te geven die het nodig had. De impact van de spelers van de bank was meesterlijk, maar dat komt omdat we 26 spelers van een zeer hoog niveau hebben," zei De La Fuente.
Portugal-middenvelder Bruno Fernandes zei: "Het is duidelijk dat we verdrietig zijn. We kwamen hier met één doel: het hele toernooi te winnen. Helaas waren we niet op ons beste niveau.
"Ik denk dat we vandaag in de eerste helft beter speelden, maar in de tweede helft maakten we dezelfde fout door te laag op het veld te verdedigen en de bal aan hen te geven. Wanneer dit gebeurt, ga je vroeg of laat een doelpunt incasseren. Gefeliciteerd aan Spanje, ze hebben kwaliteit, maar ik denk dat als we doorgingen met wat we in de eerste helft deden, we een beter resultaat hadden kunnen behalen."
Martinez, die na de wedstrijd bevestigde dat hij zijn rol als hoofdcoach verliet, prees zijn spelers ondanks de teleurstelling.
"Het Portugese volk kan trots zijn op dit team en deze spelers. Het is echt jammer. We raakten de lat. Ik denk dat we het verdienden om de wedstrijd naar verlenging te brengen. We verdedigden goed. We speelden tegen een van de favorieten om het WK te winnen. Misschien ontbrak ons gewoon een beetje geluk. Het geluk was vandaag niet aan onze zijde, maar het was een zeer gelijkopgaande wedstrijd," zei Martinez.
Het resultaat bracht een einde aan de internationale carrières van zowel Ronaldo als Martinez.